Western Blot，又稱蛋白質免疫印跡，是用來檢測蛋白質的一種技術。其原理是：首先將含有待測蛋白的蛋白質混合物進行凝膠電泳分離，然后將已經分離的蛋白質通過電泳技術從凝膠轉移到固相載體上，這一固相載體目前常用硝酸纖維素薄膜（NC膜）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）；固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變，隨后以待測蛋白質上抗原決定簇特異性的抗體（稱為一抗）為探針，與固相載體上的蛋白質進行免疫反應，最后用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶的第一抗體的抗體（稱為二抗）與一抗進行免疫反應，在有辣根過氧化物酶的底物和顯色劑存在時就會出現(xiàn)顏色反應，結合有一抗、二抗的待測蛋白，通過顏色反應既能顯現(xiàn)出來；WB的優(yōu)點是：高分辨率的電泳技術；特異敏感的抗原-抗體反應；可檢測1~5ng中等大小的靶蛋白。
Western Blot整個實驗流程可以分為蛋白樣品制備、蛋白定量、SDS-PAGE電泳、電轉移、抗體孵育顯色等五大步驟。
Western-Blot樣品制備是實驗的第一步，也是關鍵的一步，只有在獲得高質量的總蛋白的前提下才有可能通過后續(xù)步驟檢測到目的蛋白的表達；不同的樣本，提取蛋白的方法略有不同，下面簡單介紹不同樣本蛋白質的提取操作。
1.將離心管柱及接收管套管放在冰上預冷；
2.吸取細胞懸液，低速離心收集細胞，在1.5ml離心管中加入預冷的PBS，漩渦震蕩，500 xg離心2~3min，清洗細胞，吸去上清，剩余與細胞體積相同的PBS，漩渦震蕩重懸細胞；
3.按照下表1-1中相應體積的細胞裂解液，漩渦震蕩裂解細胞(細胞數(shù)量和裂解液須保證對應關系，以達到最佳提取效率)；
4.將裂解的細胞轉移到預冷的離心管柱套管中,14000~16000 xg離心30s取出；
5.立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應用于下游實驗。
1.將離心管柱及接收管套管放在冰上預冷；
2.將預冷的PBS直接加入培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗貼壁細胞，吸取上清；
3.按照表1-2中將相應體積的細胞裂解液均勻的加入整個器皿表面，用移液器吹打幾次，將裂解的細胞轉移到預冷的離心管柱套管中，14000~16000 xg離心30s取出；(如提取濃度不佳，可減少裂解液使用量）；
4.立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應用于下游實驗。
以下步驟是從15-20mg組織中提取，如果起始量較大或較小，需調整相應裂解液的用量比例：
1.將離心管柱及接收管套管放在冰上預冷；
2.將15-20mg新鮮/冷凍組織放置于離心管柱上，用塑料棍向下扭轉反復研磨50-60次，加入200μl細胞裂解液，繼續(xù)研磨30-60次；（注意：組織用量不要過量，無需過度研磨，裂解液可分兩次加入以得到最佳效果；塑料研磨棒可以重復使用，用蒸餾水徹底沖洗干凈，用紙巾擦干）；
3.蓋上蓋子室溫孵育1-2min，14000-16000 xg離心1-2min取出，收集管里的上清是抽提的總蛋白。
注：上述操作步驟及試劑用量均作為參考，具體用量以實際實驗操作及產品說明書為準。
1.收集到的臨床組織標本首先應盡快去除脂肪和壞死組織，并將蘸有的血液清洗干凈，否則影響提取蛋白定量的質量和濃度；整理干凈的標本立即放入液氮中凍存，至少應盡快放入-80℃冰箱，盡量減少蛋白的降解；
2.裂解細胞時，可將加了裂解液的樣品置于冰浴上超聲，以加快細胞的裂解，超聲間隔時間應長于或至少等于超聲工作時間，以使樣本充分冷卻，建議工作時間10~20s，超聲功率設置時不能過大，過大會造成蛋白質焦化；
3.制備好的蛋白樣品推薦根據每次實驗的用量進行分裝，做好標記，包括樣品名稱、提取日期等后存入-80℃冰箱備用，以免反復凍融加速蛋白的降解，凍存的蛋白保存時間不宜超過1個月。
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